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晶抗干貨分享:用BCA法測定蛋白質濃度
更新時間:2021-01-05   點擊次數:1660次
1.目的
 
掌握BCA法測定 蛋白質 濃度的原理。
 
2.原理
 
BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑,混合一起即成為蘋果綠,即BCA工作試劑。在堿性條件下,BCA與蛋白質結合時,蛋白質將Cu2+ 還原為Cu+ ,一個Cu+ 螯合二個BCA分子,工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復合物,*光吸收強度與蛋白質濃度成正比。
 
3.計算
 
① 繪制標準曲線。
 
② 以測定管吸光度值,查找標準曲線,求出待測血清中蛋白質濃度(g/L)。
 
③ 再從標準管中選擇一管與測定管光密度相接近者,求出待測血清中蛋白質濃度(g/L)。
 
4.實驗器材
 
① 7220型分光光度計
 
② 恒溫 水浴 箱
 
③ 中試管7支
 
④ 槍式移液管
 
5.試劑
 
①試劑A:1%BCA二鈉鹽;2%無水碳酸鈉;0.16%酒石酸鈉;0.4%氫氧化鈉;0.95%碳酸氫鈉;混合調PH值至11.25。
 
② 試劑B:4%硫酸銅。
 
③ BCA工作液:試劑A 100ml + 試劑B 2ml混合
 
④ 蛋白質標準液:用結晶牛 血清 白蛋白根據其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質標準液。(純度可經凱氏定氮法測定蛋白質含量而確定)
 
⑤ 待測樣品:用雙縮脲測定法的樣品稀釋而成。
 
6.BCA的優缺點
 
① 操作簡單,快速,45分鐘內完成測定,比經典的Lowary法快4倍且更加方便;
 
② 準確靈敏,試劑穩定性好,BCA試劑的蛋白質測定范圍是20-200μg/ml,微量BCA測定范圍在0.5-10μg/ml。
 
③ 經濟實用,除試管外,測定可在微板孔中就進行,大大節約樣品和試劑用量;
 
④ 抗試劑干擾能力比較強,如去垢劑,尿素等均無影響
 
此法測定 蛋白質 濃度,近些年被科研工作者廣泛選用。總之,雖然蛋白質含量的測定方法很多,但是,還沒有一個完美的方法。在選擇測定方法時,可根據實驗要求和實驗室條件決定。
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